原创《转录因子TDF1对拟南芥雄性不育突变体atms1的温敏调控机制》：本论文可用于转录因子论文范文参考下载，转录因子相关论文写作参考研究。
摘 要：
TDF1作为MYB家族的转录因子,参与了胼胝质的降解过程,并控制绒毡层的分化从而影响着花粉粒的正常发育.以一株通过磺酸乙酯（EMS）诱变Col-0野生型拟南芥获得的温敏雄性不育突变体atms1（ambient temperature-sensory male sterility1）对温度敏感机制进行了研究.通过构建TDF1反义RNA表达载体,在atms1突变体背景下抑制TDF1的表达来观察突变体花粉育性的变化,发现在27℃时的atms1突变体花粉的育性得以恢复.这一结果表明在花粉发育的过程中TDF1对ATMS1m具有一定的调控作用.
关键词：
atms1；温敏雄性不育； TDF1； 花药育性； Real-time PCR
中图分类号： Q 94 文献标识码： A 文章编号： 10005137（2014）03025907
在拟南芥的花药发育过程中,已知有一些转录因子在调控中起到决定性的作用[1]：如bHLH家族的转录因子,MYB家族的转录因子等[2].其中MYB家族的转录因子如：TDF1[3-5]（TAPETAL DEVELOPMENTAND FUNCTION1）编码的是MYB-R2R3家族的转录因子.它主要在绒毡层以及小孢子母细胞中表达,突变体中因绒毡层发育异常,导致胼胝质无法降解,使得小孢子聚集在花粉囊中,不能形成正常的花粉粒,最终引起雄性不育表型.
本实验室在前期的研究中得到了1株在非胁迫温度范围内花粉育性受温度显著影响的拟南芥温敏雄性不育突变体atms1[6].在16 ℃时,该突变体育性与野生型相似,花粉全部可育；但随温度的升高,育性逐渐下降,到23 ℃时,突变体花粉有一半表现为不育；而到27℃时,突变体花粉则全部不育.经过对突变基因的图位克隆,发现该突变体在AT1G62940基因上的第四外显子202 bp处发生点突变,由“G”变为“A”（图1～2）,ATMS1编码的蛋白第398个氨基酸由野生型的甘氨酸变为天冬氨酸.
图1 AT1G62940基因上的第四外显子上发生点突变
本实验就是通过在拟南芥atms1突变体中过量表达TDF1反义RNA,结合对atms1温敏雄性不育表型的分析,拟从遗传分子水平初步探究其中的作用机制.
1 材料与方法
1.1 材 料
Col-0生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）及atms1温敏雄性不育突变体种子由本实验室提供.
图2 ATMS1 CDS序列上的突变位点
菌株DH5ɑ（E.Coli）和3101（Agrobacterium tumefaciens）为本实验室自制感受态细胞并保存；载体pCAMBIA-1300为本实验室所有并改造后使用；载体pMD18-T、DNA Marker、各种限制性内切酶、T4连接酶均购自TaKaRa公司.
1.2 方 法
1.2.1 植物cDNA的提取
Col野生型拟南芥23 ℃条件下培养,待其抽薹后,取花序,迅速置于液氮中,Trizol法提取RNA,反转录得cDNA,Trizol等试剂及cDNA反转录试剂盒均购自TaKaRa公司.
1.2.2 引物设计及TDF1基因片段的克隆
自www.arabidopsis.org网站上下载TDF1的CDS序列,大小为954 bp.根据CDS序列设计引物,上下游引物两端分别添加Sal I和Xba I酶切位点.引物由上海生工生物工程公司进行合成.
引物序列为：上游F（Sal I） 5′-GCGTCGACATGGGAAGACCTCCTTGTT-3′,
下游R（Xba I） 5′-CGTCTAGACTAATAATCGAAATCATTCAAGAG-3′.
采用PCR方法对目的序列进行扩增,扩增采用TaKaRa公司生产的KOD PCR扩增试剂盒.
扩增条件参数为：
由高保真聚合酶扩增得到的PCR产物割胶回收后,加PolyA并纯化,与pMD18-T载体连接,得到pMD18-T-TDF1.采用热激法将重构的T质粒转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中进行扩增,重组T质粒经酶切鉴定正确后送往上海美吉公司进行测序.
1.2.3 表达载体构建
图3为本实验室改造后的pCAMBIA-1300质粒图谱.首先,将p1300质粒用Sal I、Xba I进行酶切并回收质粒片段.然后从pMD18-T载体上切取
测序正确的带有Sal I、Xba I酶切位点的TDF1 CDS片段,回收后连入p1300质粒中,并将重组质粒转化大肠杆菌进行筛选和鉴定.
1.2.4 农杆菌的转化与鉴定
采用热激法将重组质粒p35S：TDF1（-）转化到根癌农杆菌3101中.在含有Rifa,Kana和Gen三重抗性的YEP固体培养基上进行筛选,挑取单菌落进行PCR检测.将鉴定正确的菌落接种到YEP液体培养基中进行扩增培养,利用浸染法[7-9]转化拟南芥atms1杂合子植株,收取T0代种子.
1.2.5 阳性苗筛选及鉴定
用50 μg/mL潮霉素B（Hygromycin B）对转化的T0代种子进行筛选,待抗性板上长出阳性苗后,将其移入土中生长.直至抽薹后,取2～3片叶子,用Edwards一步抽提法提取植株基因组DNA,进行遗传背景鉴定.
1.2.6 花药育性观察
将阳性植株置于23 ℃的培养间生长,待其抽薹后,分两组分别放到16、27 ℃的人工气候培养箱中培养,2 d后重新置于23 ℃培养间中生长,取温度处理时处于花药发育第八期的花,用亚历山大染色法处理后,观察花粉育性.
转录因子论文参考资料：
结论：转录因子TDF1对拟南芥雄性不育突变体atms1的温敏调控机制为关于本文可作为转录因子方面的大学硕士与本科毕业论文转录因子论文开题报告范文和职称论文论文写作参考文献下载。
