原创《黑麦草EST—SSR分子标记开发与生物信息学分析》：本论文为您写分子标记毕业论文范文和职称论文提供相关论文参考文献，可免费下载。
摘 要：为加速分子标记在黑麦草中的应用,利用黑麦草EST数据库（GenBank/dbEST）开展了黑麦草EST-SSR信息分析、标记开发和EST功能分析研究.在25 752条黑麦草EST序列中,共发现346条SSR序列,占整个EST总数的1.344%.其中,三核苷酸基序最多（39.60%）,次之为二核苷酸基序（31.79%）.三核苷酸基序以GGC/CCG出现频率最高,为8.38%,其次是CGC/GCG（7.51%）、GCC/CGG（4.05%）和ATG/TAC（2.02%）,二核苷酸基序以CT/GA出现频率最高（14.45%）,其次是GA/CT（10.98%）.根据这些含有SSR的EST序列,利用Primer Premier 5.0软件,对346条EST-SSR序列进行引物设计,共设计引物193对,其中分值在90分以上的有113对（32.66%）.利用GenBank的BlastN和BlastX程序对相应113条EST进行功能分析,72条EST序列与51种具有生物学功能的蛋白质同源.
关键词：黑麦草；EST-SSR；信息分析；引物设计；功能分析
中图分类号：S543+.601文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）10-0001-06
黑麦草属禾本科（Poaceae）黑麦草属（Lolium）植物.其中最具有商业价值的两个种为多年生黑麦草（Lolium perenne L.）和多花黑麦草（Lolium multiflroum L.）,作为草坪草和优质牧草在我国均有大面积栽培和利用[1,2].
目前,黑麦草中常用的分子标记技术主要有RAPD[3]、CAPS[4]、AFLP[4,5]、SSR[6]、EST-SSR[7]等.SSR（simple sequence repeat）标记在遗传图谱的构建[8]、遗传多样性和亲缘关系分析[9]、品种指纹图谱及纯度鉴定[10]、功能基因标记[11]等方面具有公认的优越性和广阔的应用前景.但传统的基因组SSR标记开发投入多、耗时长.近年来,随着GenBank中大量EST（expressed sequence tags）序列的公布,许多植物基于EST的SSR（EST-SSR）标记开发成为可能.与基因组SSR相比,EST-SSR具有开发成本低、物种间通用性高、可直接反映相关基因的多样性等突出优点.目前许多作物如小麦、大麦、高羊茅、蒺藜苜蓿等的EST-SSR已被开发并用于遗传作图、遗传多样性、基因发掘、比较作图等研究[12-15].
本研究利用NCBI上的黑麦草EST序列查找SSR,对其进行信息分析,设计EST-SSR引物,开发黑麦草EST-SSR分子标记,并对相应EST进行功能分析.
1材料与方法
1.1EST序列来源
从http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/下载黑麦草EST序列.
1.2EST-SSR的查找
登陆网站http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool,利用SSRIT（simple sequence repeat identification tool）软件在线查找二、三、四、五、六核苷酸5种类型的SSR.识别标准为：重复基序最小长度≥18 bp,即二、三、四、五、六核苷酸重复次数分别大于或等于10、7、5、4、3.
1.3EST-SSR引物设计
利用Primer Premier 5.0软件,根据SSR的侧翼区域设计引物.引物设计的主要参数：EST序列长度大于100 bp；SSR序列的开始和结束位置分别距5′和3′端不少于20 bp；引物长度18～22 bp；退火温度Tm值 50～65℃,而且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；PCR扩增产物长度100～300 bp；做到分90分以上,尽量避免引物二级结构的出现.
1.4EST功能分析
利用NCBI网站对筛选出的黑麦草EST序列进行Blast比对,包括BlastN和BlastX两种比对,做到到与其他植物已知基因或蛋白相似的功能,获得该EST在草坪草中的预测功能.利用BlastN程序在核苷酸水平上进行同源性分析,认为序列比分值大于200,e-value ≤1×10-20的序列具有同源核苷酸片段,而比对的片段长度小于50 bp结果不予采纳；对符合上述要求的EST序列利用BlastX程序在翻译水平上对其进行分析,序列比分值大于80的结果认为有相似性显著的同源蛋白质.
2结果与分析
2.1源于黑麦草EST的SSR查找
从NCBI上共下载到黑麦草的25 752条EST序列（其中多年生黑麦草19 784条,多花黑麦草5 968条）.经SSR查找,共发现346条SSR序列,占整个EST数据库的1.344%；这些EST序列全长17 720 kb,平均每1 000 kb 出现19.53个SSR,即每51.21 kb出现1个SSR.含有二、三、四和五核苷酸重复基序分别占SSR总数的31.79%、39.60%、11.27%和17.34%,无六核苷酸重复基序,三核苷酸基序出现频率最高,次之为二核苷酸基序（表1）.
2.2黑麦草EST-SSR的特征分析
346个SSR中,二核苷酸基序以CT/GA出现频率最高,占SSR总数的14.45%,其次是GA/CT（10.98%）和AT/TA（1.73%）.三核苷酸基序以GGC/CCG出现的频率最高,为8.38%,其次是CGC/GCG（7.51%）、GCC/CGG（4.05%）和ATG/TAC（2.02%）,其他类型出现频率较低.四核苷酸基序以GTTG/CAAC出现频率最高,为0.87%.五核苷酸以TGTCG/ACAGC（2.31%）和CTCAT/GAGTA（2.02%）出现频率较高,其余出现频率均较低（表2）.
分子标记论文参考资料：
结论：黑麦草EST—SSR分子标记开发与生物信息学分析为关于对写作分子标记论文范文与课题研究的大学硕士、相关本科毕业论文分子标记论文开题报告范文和相关文献综述及职称论文参考文献资料下载有帮助。
