原创《苦瓜McAPX2基因其启动子克隆和表达分析》：本文是一篇关于启动子论文范文，可作为相关选题参考,和写作参考文献。
摘 要 基于苦瓜叶片均一化文库克隆得到McAPX2基因的cDNA全长序列（GenBank登录号：KJ722767.1）,采用染色体步移法获得该基因的启动子序列,实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同器官中的表达量及低温胁迫对McAPX2表达量的影响.结果表明：McAPX2基因全长1 086 bp,开放阅读框747 bp,编码249个氨基酸；McAPX2属于过氧化物酶家族ClassⅠ的成员,其脂肪族氨基酸指数为83.90,是一个亲水性蛋白,可推测定位于细胞质中；和甜瓜（NP_001284378.1）、黄瓜（ACO90193.1）、南瓜（AHF27424.1）、苦瓜（AGJ72851.1）同源性較高,分别为95%,94%,94%和93%；qRT-PCR结果显示,在苦瓜的根、茎、叶、雌花和幼果等组织器官中McAPX2的表达量存在显著差异,其中根的表达量最大,而在叶片中的表达量最低；在低温胁迫下,随着胁迫时间的延长,McAPX2表达量逐渐上调,处理12 h时达到最大,随后下降,说明该基因的表达和苦瓜耐低温胁迫相关.分离得到McAPX2基因上游调控序列1 267 bp,其启动子含有和GA、ABA、CTK、乙烯等激素和病原菌等生物胁迫以及热激、干旱、低温、光等非生物胁迫的相关元件.
关键词 苦瓜；McAPX2基因；启动子；表达分析
中图分类号 S642.5 文献标识码 A
低温胁迫打破植物细胞内活性氧（active oxygen, ROS）产生和消除的平衡机制,造成活性氧含量大幅增加,引发氧化胁迫,致使植物生长发育受阻,甚至死亡[1].H2O2是一种较稳定的ROS物质,可以轻易地穿过植物细胞膜,生成最活跃的ROS物质——羟自由基（·OH-）,进而干扰植物细胞光电子传递,影响膜系统稳定性,氧化大分子物质,造成细胞程序性死亡[2-4].因此,及时清除过多H2O2对维持植物正常生理功能起重要作用.
抗坏血酸-谷胱甘肽循环（ascorbate-glutathione cycle, AGC）是高等植物长期进化产生的有效清除活性氧的保护机制之一[5],抗坏血酸过氧化物酶（APX, ascorbate peroxidase）是AGC清除H2O2的关键酶,其以抗坏血酸（AsA）为特殊电子供体（AH2）,催化H2O2还原成H2O[6-7].目前已从多种作物克隆出APX基因,许多研究发现APX基因参和植物响应氧化胁迫应答[8-14].
中国南方冬春持续低温是影响设施大棚苦瓜（Momordica charantia L.）生长、发育、产量和品质形成的主要限制因子,但有关苦瓜低温胁迫分子机制研究尚未见报道.本试验从前期构建的苦瓜叶片均一化cDNA文库中获得一个EST序列,发现其和抗坏血酸过氧化酶基因高度同源.本研究以该序列设计特定引物,利用RACE技术克隆出苦瓜APX基因全长序列,分析其特征特性和在低温胁迫下时空表达模式,分离并分析McAPX基因的启动子,为进一步研究苦瓜APX在低温胁迫下的功能奠定基础,以期为苦瓜耐低温育种提供理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为苦瓜强雌系‘24-K’（Subgynoecious line,24-K）,由福州市蔬菜科学研究所苦瓜课题组提供,参照高山等[14]方法,采用DSN和 ARTTM技术相结合构建苦瓜叶片均一化全长cDNA文库,基因克隆和表达在福建省农业科学院作物研究所内完成.
1.2 方法
1.2.1 初花期苦瓜低温处理 试验于2013年9月中旬进行,将供试‘24-K’的苦瓜种子用60 ℃温水处理30 min,常温浸种12 h后,播种于10 cm×15 cm的营养钵中,营养基质为泥炭土 ∶ 珍珠岩 ∶ 蛭石等于7 ∶ 1 ∶ 2（体积比）,每个营养钵中保按照常规方法管理.待苦瓜长至9叶1心,出现雌蕊时,选择生长势一致的植株分别移置2台智能型人工气候箱（MGC-350HP-2）进行处理.（1）处理组A：温度8 ℃,湿度为60%,光强为200 μmol/（m2·s）,光周期12 h/12 h；（2）处理组B或对照组：温度25 ℃,其它条件相同.在0～24 h内分别于0、1、3、6、12、
24 h定时取各处理单株第5片功能叶,经液氮速冻后,置于-80 ℃冰箱备用,进行基因表达分析.每个处理随机取6株,设3次重复.
1.2.2 苦瓜基因组DNA和总RNA提取纯化 采用改良CTAB法提取苦瓜强雌系24-K的基因组DNA[15]；采用改良Trizol RNA提取试剂盒（Invitrogen）方法,分别提取苦瓜强雌系24-K开花初期（9叶1心）根、茎、叶、雌花和授粉5 d幼果的总RNA,用于McAPX2在苦瓜不同部位的表达分析.采用上述方法分别提取经不同时间低温处理和对照处理的苦瓜叶片总RNA,用于McAPX2表达模式分析.用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA、总RNA 完整性,用紫外分光光度计检测基因组DNA、总RNA的浓度和纯度.
1.2.3 McAPX2基因的克隆 在已构建苦瓜叶片均一化cDNA文库基础上,测序后去除引物和载体片段,在Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列同源性比对分析,获得一个和多种植物APX基因有很高同源性的EST序列,该基因cDNA全长1 086 bp.利用软件Primer 5.0 设计ORF上下游引物McAPX-ORF-F/R（见表1）,以稀释100倍文库为模板进行PCR扩增,回收的目的条带,克隆到TaKaRa的pMD18-T载体上,转化感受态细胞DH5α,筛选出阳性克隆,委托上海英骏生物技术公司测序,进行新基因验证.
1.2.4 McAPX2启动子的分离 根据苦瓜McAPX2的全长cDNA序列,从起始*子下游200 bp内设计巢式引物A2GSP-1,A2GSP-2和A2GSP-3.参照刘志钦等[16]方法和Genome Walking kit试剂盒说明书,以纯化的苦瓜‘24-K’基因组DNA为模板,进行3轮巢式PCR,分离克隆McAPX2上游调控区域的启动子序列.PCR产物纯化回收并克隆至pMD18-T载体上,委托上海英骏生物技术公司测序.
启动子论文参考资料：
结论：苦瓜McAPX2基因其启动子克隆和表达分析为关于启动子方面的论文题目、论文提纲、启动子有几种论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文。
