原创《海南省象耳豆根结线虫鉴定》：本文关于豆根论文范文,可以做为相关论文参考文献,与写作提纲思路参考。
摘 要 象耳豆根结线虫寄主范围广、致病力强以及能在携带Mi抗性基因的作物上寄生繁殖,是热区最具危害性的病原根结线虫种类之一.应用比较形态学,结合mtDNA序列分析、IGS序列分析和进化发育树等分子生物学方法对海南省18个市县的根结线虫进行鉴定,确定象耳豆根结线虫在蔬菜、番石榴、哈密瓜和枣树等作物上广泛发生为害,其中枣树为首次发现的象耳豆根结线虫新寄主.研究结果表明,象耳豆根结线虫已成为海南省蔬菜作物上重要的病原根结线虫种,并有进一步扩散加重为害的趋势.
关键词 象耳豆根结线虫；鉴定；会阴花纹；线粒体DNA；进化分析
中图分类号 S436.3 文献标识码A
象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）是近几年引起广泛关注和重视的一个热带根结线虫新种,在亚洲、非洲、欧洲以及北美热带和亚热带地区均有发生分布[1].该线虫具有极其广泛的寄主范围,包括豆科、茄科、葫芦科中的多种蔬菜,以及大豆、玉米、棉花、烟草、番石榴和荔枝等重要粮食和经济作物[2-3].和南方根结线虫（M. incognita）和爪哇根结线虫（M. javanica）等主要根结线虫种类不同的是,象耳豆根结线虫能够克服Mi、N和Rk等抗线虫基因介导的抗性反应,在抗性番茄、辣椒和豇豆等蔬菜上寄生繁殖,造成的产量损失可达到65%以上[1,4].此外,象耳豆根结线虫被证实和在欧洲和美国广泛发生的玛雅古根结线虫（M. mayaguensis）为同种异名[5].目前,象耳豆根结线虫已被国际上公认为最具危害性的植物病原线虫之一,欧洲和地中海植物保护组织将其列入了A2警报名录[6].
象耳豆根结线虫最早在海南儋州象耳豆树上发现,自1983年首次报道后的20多年时间内一直被认为是少数种或次要种而受到长期忽视[7].近年来,陆续有报道象耳豆根结线虫在海南儋州、三亚、琼海、澄迈、陵水等市县的蔬菜和水果上发生为害[8-10].刘昊等[8]对儋州、琼海和澄迈三地的番石榴上分离的9个根结线虫种群进行鉴定,结果表明全部为象耳豆根结线虫.卓侃等[9]在海南海口和定安的木豆上分离到象耳豆根结线虫,并且首次在广东发现该线虫为害南瓜和辣椒.随后,海南文昌、陵水、东方等地的多种瓜果蔬菜和沉香、丁香上均发现象耳豆根结线虫寄生为害[10-11].越来越多的研究结果表明,象耳豆根结线虫在海南岛快速扩散蔓延,并有可能成为海南当地作物尤其是瓜果蔬菜上的重要根结线虫种类.
海南省地处热带,根结线虫病害发生严重,且存在的根结线虫种类繁多.对根结线虫的鉴定,传统的方法主要是依据会阴花纹的形态特征,但根结线虫不同种群之间具有较大变异[12].此外,热带根结线虫种类尤其一些少数种如西班牙根结线虫（M. hispanica）、埃塞俄比亚根结线虫（M. ethiopica）在会阴花纹特征上往往和常见种具有高度的相似性,很难区分而容易导致鉴定结果不够准确[13-14].例如,象耳豆根结线虫会阴花纹部分形态和南方根结线虫相似,曾被错误鉴定为南方根结线虫[15].鉴于象耳豆根结线虫毒性强、危害大的特点,2011～2014年笔者对采自海南省18个市县的根结线虫群体进行分离,并利用比较形态学和分子生物学相结合的方法对象耳豆根结线虫进行鉴定,旨在明确象耳豆根结线虫是否已扩散至海南省全岛分布,同时也为准确鉴定及防治该线虫提供依据和理论基础.
1 材料和方法
1.1 材料
2011～2014年在海南省18个市县采集具有明显“根结”症状的作物病根,带回实验室内编号后分离根结线虫.所获病根样品用清水轻轻冲洗干净,经1%食用色素亮蓝染色后在解剖镜下挑取单卵囊,并接种于感病番茄（cv. 特级大明星）上进行种群纯化培养和活体保存.
1.2 方法
1.2.1 线虫形态学观察和测定 取接种单卵囊40 d左右的病土和番茄病根,采用浅盆法从病土中分离获得根结线虫二龄幼虫,雌虫用挑针和镊子从病根组织中直接分离获得.参照刘维志[16]所描述的方法进行线虫的杀死、固定以及制作临时玻片.显微镜下进行观察、测量并记录二龄幼虫体长、最大体宽、DGO、口针长度、尾长等形态指标,每个种群观察样本数为20头幼虫.参照张绍升[17]所描述的方法制作雌虫会阴花纹,在显微镜下观察拍照保存.
1.2.2 线虫DNA提取 参照万新龙[18]所描述的方法,略有修改.显微镜下挑取单头二龄幼虫置于含有10 μL灭菌双蒸水的PCR管中,点动离心后放入液氮中速冻30 s,随后37 ℃水浴30 s进行虫体冻融破碎,重复3次.加入8 μL 10×PCR Buffer（TaKaRa）,2 μL蛋白酶K（20 mg/mL）,轻弹混匀后PCR仪中65 ℃温育90 min,接着95 ℃保温10 min.样品于13 000 r/min离心1 min,取其上清液用于PCR扩增或者于-20 ℃保存备用.
1.2.3 mtDNA序列扩增 利用Powers等[19]设计的上下游引物对 #C2F3（GGTCAATGTTCAGAAATTT
GTGG）和#1108（TACCTTTGACCAATCACGCT）扩增根结线虫线粒体DNA（mtDNA）coⅡ（细胞色素氧化酶亚基Ⅱ）和lrRNA基因间序列.PCR反应使用Ex Taq酶PCR扩增试剂盒（TaKaRa）,总体系为50 μL,其中10×PCR Buffer 5 μL,dNTPs 4 μL,Mg2+ 3 μL,上下游引物各1 μL,Ex Taq酶0.25 μL,DNA模板5 μL,灭菌双蒸水30.75 μL.PCR扩增褪火温度为53 ℃,共35个循环.PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测观察,并对目的条带进行切胶回收、连接、转化,最后挑取阳性克隆送华大基因公司测序.
1.2.4 rDNA- IGS2序列扩增 利用Long等[20]设计的象耳豆根结线虫特异引物对MeF（AACTTTTGT
豆根论文参考资料：
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