原创《基于高通量测序技术分析石蝉草内生细菌多样性》：本论文可用于石蝉草论文范文参考下载，石蝉草相关论文写作参考研究。
摘 要 以石蝉草根、茎、叶为材料,采用Illumina MiSeq高通量测序技术研究石蝉草内生细菌多样性.结果表明,根、茎、叶样品共测得167个OTUs,归属于11个门,分别为变形菌门、Ignavibacteriae、芽单胞菌门、梭杆菌门、厚壁菌门、异常球菌-栖热菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门,各样品的菌群组成和多样性虽有差异,但以變形菌门为优势菌群,约占62.48%～93.24%.在各样品菌群丰度最高的10个OTUs中,叶部优势群落芽孢杆菌属、根部特有群落粘球菌目和石蝉草中具有抗炎、抗肿瘤活性的物质存在潜在相关性.
关键词 石蝉草；内生细菌；高通量测序；多样性
中图分类号 S567 文献标识码 A
Abstract In this study, the species and diversity of endophytic bacteria in the root, stem and leaf of Peperomia dindygulensis Miq. were comprehensively investigated by highthroughput sequencing technology based on Illumina Miseq platform. The results showed that the number of OTUs were 167 in total which belonged to 11 phyla respectively as Proteobacteria, Ignavibacteriae, Gemmatimonadetes, Fusobacteria, Firmicutes, Deinococcus-Thermus, Chloroflexi, Bacteroidetes, Actinobacteria and Acidobacteria. There were differences in the community composition and diversity of endophytic bacteria from different samples, but the dominant groups of 3 samples were Proteobacteria, accounting for 62.48%-93.24%. In this research, it is showed that Bacillus and Myxococcus on genus level were specifically located in the leaf and root, respectively. These may have some correlation with preferable anti-inflammation and anti-tumor effects.
Key words Peperomia dindygulensis Miq.； endophytic bacteria； high-throughput sequencing； diversity
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.017
石蝉草（Peperomia dindygulensis Miq.）系胡椒科草胡椒属植物,多分布于中国南方各省区.《中华本草》、《云南中草药选》等对其均有记载,其味辛、性凉,具有清热解毒、化瘀散结、利水消肿的功效,对肺癌、肝癌、胃癌等有治疗作用[1].
植物内生菌是指定殖于健康植物组织内部,而又不引发宿主植物表现出明显感染症状的一类微生物[2].在和宿主植物协同共生的过程中,植物内生菌可产生和宿主植物相同或相似的代谢产物,包括萜类、芳香类等化合物,这些物质具有多种生物学活性,如抗菌、降糖等[3].已有研究表明中药材中部分活性成分的形成和其内生菌有关,Strobel等[4]分离于红豆杉韧皮部的内生真菌紫杉霉（Taxomyces anreanae）可以产生紫杉醇或其他紫杉烷类化合物,该类物质对多种恶性肿瘤具有突出疗效；崔晋龙等[5]利用3株活性真菌开展了野外诱导白木香产生沉香的试验,试验证明此方法可应用于沉香的实际生产；陶金华等[6]研究茅苍术内生真菌时发现,内生真菌诱导子能有效提高茅苍术细胞悬浮培养体系中苍术素的产量.
目前,国内外对石蝉草的研究多集中于化学成分的分离鉴定及其生物活性[1,7],而忽视了植物内生菌在中药材形成中所发挥的作用.陈立[1]研究发现石蝉草抗癌活性成分主要集中在氯仿和乙酸乙酯部位,单体化合物以断联木脂素活性较好.本试验以石蝉草根、茎、叶为研究对象,采用16S rRNA扩增子高通量测序技术对石蝉草的内生菌菌群多样性结构进行分析,旨在探究石蝉草内生细菌种类多样性,为更好地保护和开发利用石蝉草资源提供科学依据.
1 材料和方法
1.1 材料
2015年10月上旬于云南省文山州马关县采集生长健壮的石蝉草全株,不同部位样品从植株分离后立即装入无菌采样袋中,低温保鲜,于48 h内进行内生细菌的分离,取石蝉草根、茎、叶为分析样品,样品名依次为ROOT、STEM和LEAF.
1.2 方法
1.2.1 表面消毒 取石蝉草根、茎、叶样品,用自来水洗净,75%酒精震荡浸泡1 min,转入2%次氯酸钠震荡5 min,无菌水漂洗5次.取最后1次漂洗水涂布于NA平板作为对照,以此检验表面消毒是否彻底.
1.2.2 DNA提取、PCR扩增和测序 石蝉草根、茎、叶样品总DNA提取参照陈泽斌等[8]的方法.因植物质体对细菌16S rRNA基因的扩增具有极大的污染,本研究采用多重PCR方法对植物来源污染进行抑制,两轮PCR体系不变,仅变换引物并更改相应退火温度.在PCR扩增过程中使用2对引物分别进行两轮PCR,第一轮PCR为抑制植物质体污染,所用引物为P63F（5"-GTCGAACGGGAAG TGGT-3"）和P1490R（5"-CTTCACTCCAGTCGCAA GC-3"）,退火温度为68 ℃；随后取第一轮PCR线性扩增产物进入第二轮16S rDNA基因V4区的扩增,其扩增引物为515F（5"-GTTTCGGTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3"）和806R（5"-AGTTCCGGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3"）,退火温度为54 ℃.16S扩增子PCR体系为10×PCR Buffer for KOD-PlusNeo,5 μL；2 mmol/L dNTPs 5 μL；25 mmol/L MgSO4 3 μL；引物10 μmol/L,各1.5 μL；KOD-Plus-Neo DNA聚合酶,1 μL；ddH2O,32 μL；模板DNA,1 μL.PCR扩增体系为预变性94 ℃,2 min,1个循环；变性98 ℃,10 s,退火,30 s,延伸68 ℃,30 s,26个循环；延伸72 ℃,5 min,1个循环；25 ℃恒温.16S rRNA基因V4区扩增子PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶凝胶电泳分离后切胶纯化回收,回收产物送成都罗宁生物科技有限公司进行16S rDNA基因扩增子高通量测序.高通量测序文库使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit试剂盒构建350 bp小片段文库,随后使用Qubit 2.0进行浓度定量后使用Illumina公司MiSeq Reagent Kit v3试剂盒在Illumina Miseq测序仪上完成高通量测序.
石蝉草论文参考资料：
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