原创《独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞表达miRNA—140影响》：关于免费独活寄生汤论文范文在这里免费下载与阅读,为您的独活寄生汤相关论文写作提供资料。
【摘 要】目的：观察独活寄生汤含药血清对体外培养的大鼠退变软骨细胞表达miRNA-140的影响,探讨独活寄生汤防治骨关节炎的作用机制.方法：4周龄SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,采用Ⅱ型胶原原位杂交法对第3代（F3）软骨细胞进行鉴定.用10 ng·mL-1白细胞介素-1β诱导F3软骨细胞,复制退变软骨细胞模型.成功后随机分为模型组和独活寄生汤含药血清组,分别在培养24,48,72 h后采用TaqMan real-time PCR法检测各组miRNA-140表达.结果：独活寄生汤含药血清组
miRNA-140相对表达量随着干预时间的延长逐渐增加,差异有统计学意义（P < 0.05）.结论：独活寄生汤治疗骨关节炎的部分作用机制是有效促进退变软骨细胞miRNA-140的表达.
【关键词】 骨关节炎；独活寄生汤；含药血清；软骨细胞；miRNA-140
骨关节炎（osteoarthritis,OA）属中医学“痿证”“痹证”“骨痹”范畴,肝肾亏虚致其虚为病之内因,风寒湿邪致其痹为病之外因,故本质为本虚标实、本痿标痹[1].独活寄生汤出自唐·孙思邈《备急千金要方》,具有扶正祛邪、标本兼顾的特点,能针对OA的病因病机起治疗作用,能有效缓解膝OA的临床症状[2-3].实验研究发现,独活寄生汤能有效促进软骨细胞增殖[4-5],抑制软骨细胞凋亡[6],延缓软骨退变[7],但其作用机制尚未完全明确.本实验通过观察独活寄生汤含药血清对白细胞介素（IL）-1β诱导的退变软骨细胞表达miRNA-140的影响,进一步探讨独活寄生汤治疗OA的作用机制.
1 实验材料
1.1 实验药物 独活寄生汤由独活9 g,桑寄生、秦艽、杜仲、防风各6 g等组成,由福建中医药大学附属第二人民医院药剂科提供.使用时用蒸馏水1 L,煎煮2次,每次煎1 h,将2次药液合并,浓缩成1 g·mL-1,保存在-20 ℃冰箱中,备用.
1.2 实验动物 2月龄清洁级雄性SD大鼠24只,体质量（250±10）g；4周龄SD大鼠10只,体质量（100±10）g,均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证号：SCXK（沪）2012-0002.福建中医药大学实验动物中心具备清洁级医学实验动物环境设施,许可证号：SYXK（闽）2014-0006.
1.3 试剂和仪器 胎牛血清（FBS,美国Gibco公司）；IL-1β细胞因子（美国Peprotech公司）；DMEM低糖培养基（美国Hyclone公司）；兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体,大鼠IgG二抗,免疫组化试剂盒（北京中杉金桥试剂公司）；提取试剂盒mirVana? miRNA Isolation Kit（美国Thermo Scientific公司）；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific公司）；TaqMan实时荧光定量PCR试剂,探针标记的miRNA-140（引物系列：CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG）、U6（引物系列：AGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTC）及PCR mastermix（美国Invitrogen公司）；ABI 7500实时荧光
定量PCR仪（Applied Biosystems公司）；二氧化碳培养箱（Heraeus公司）；荧光倒置显微镜（徕卡仪器公司）；超净工作台（北京东联哈尔仪器公司）.
2 方 法
2.1 独活寄生汤含药血清的制备 根据随机数字表法将24只2月龄SD大鼠随机分为空白血清组和含药血清组,每组12只.给药剂量参照药理实验中动物间和动物和人体间的等效剂量换算[8],含药血清组大鼠给予4.65 g·kg-1·d-1独活寄生汤灌胃,早晚各1次；空白血清组大鼠给予每日
2次4.65 mL·kg-1·d-1生理盐水灌胃.连续灌胃7 d,最后一天连续2次灌胃,中间间隔2 h.采血前禁食12 h,2 h后在质量分数为10%水合氯醛麻醉下腹主动脉采血.将所得全血在37 ℃恒温水浴箱中静置30 min后,离心机3000 r·min-1离心15 min,取上清于56 ℃水浴锅中灭活30 min,0.22 μm一次性针头滤器过滤,-20 ℃保存备用.
2.2 软骨细胞的培养 将4周龄SD大鼠,用体积分数为750 mL·L-1的乙醇浸泡后,分离双侧膝关节,带入无菌操作台,取胫骨平台和股骨下端的软骨,剪成1 mm3大小,转移入盛有质量分数为0.2%Ⅱ型胶原酶的培养瓶,37 ℃恒温水浴摇床上消化2 h,取上清液,200目尼龙网筛過滤,离心机1000 r·min-1离心5 min,收集细胞沉淀,用含质量分数为10%的胎牛血清的DMEM低糖培养基（含青霉素、链霉素各100 U·mL-1）重悬细胞,封口放置.原消化瓶中再加入Ⅱ型胶原酶5 mL,重复以上步骤2次,获取细胞悬液.把3次消化所得的软骨细胞悬液混匀,用含质量分数为10%的胎牛血清的DMEM低糖培养基调整细胞浓度为1×105·mL-1,接种于25 cm2培养瓶中,每瓶加5 mL,置于37 ℃、含体积分数为5%的CO2的培养箱中进行培养（F0）,待瓶底铺满80%后,进行传代培养,依次标记为第1代软骨细胞（F1）,第2代软骨细胞（F2）,第3代软骨细胞（F3）.
2.3 退变软骨细胞模型的复制及鉴定 F3软骨细胞以1×105·mL-1的浓度接种于25 cm2培养瓶中,用含10 ng·mL-1 IL-1β无血清基础培养基诱导
24 h复制退变软骨细胞模型[9].同时运用倒置显微镜观察,免疫组化等方法鉴定退变软骨细胞.免疫组化方法参照SABC免疫组化试剂盒说明书进行,简要步骤如下：取出预先置于25 cm2培养瓶底部的盖玻片,多聚甲醛固定15 min；用质量分数为3%的H2O2孵育10 min；质量分数为0.1%的Triton X-100 PBS液37 ℃孵育30 min；37 ℃血清封闭10 min.一抗37 ℃温育1 h；PBS液清洗5 min,3次；二抗37 ℃孵育30 min.DAB显色,苏木素复染,中性树脂封片,光镜观察.
独活寄生汤论文参考资料：
结论：独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞表达miRNA—140影响为关于对写作独活寄生汤论文范文与课题研究的大学硕士、相关本科毕业论文独活寄生汤的功效与作用论文开题报告范文和相关文献综述及职称论文参考文献资料下载有帮助。
